Test PCR

Maximilian Reindl studiował chemię i biochemię na LMU w Monachium, a od grudnia 2020 roku jest członkiem zespołu redakcyjnego Zapozna się dla Ciebie z tematyką medyczną, naukową i polityką zdrowotną, aby były zrozumiałe i zrozumiałe.

Więcej postów Maximilian Reindl Wszystkie treści są sprawdzane przez dziennikarzy medycznych.

Testy PCR stały się nieodzowną częścią współczesnej medycyny i diagnostyki molekularnej. Ponieważ są tak precyzyjne, są uważane za „złoty standard”. Mogą być wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań, od wykrywania patogenów po badania przesiewowe w kierunku chorób dziedzicznych – czyli wszędzie tam, gdzie konieczne jest niezawodne wykrycie nawet najmniejszych śladów materiału dziedzicznego. Dowiedz się tutaj, dlaczego test PCR jest tak precyzyjny, gdzie jest używany i jak działa szczegółowo.

Co to jest test PCR?

Test PCR to metoda laboratoryjna z biologii molekularnej i medycyny. Test służy do bezpośredniego wykrywania – i charakteryzowania – materiału genetycznego. Metoda PCR jest uważana przez ekspertów za łatwą do przeprowadzenia, uniwersalną i solidną.

W laboratorium test PCR składa się z dwóch etapów. W pierwszym etapie istniejący materiał genetyczny jest odtwarzany za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy, w skrócie PCR. W ten sposób można zbadać najmniejsze ślady DNA. Jest to również powód, dla którego testy PCR są tak czułe.

W drugim etapie materiał genetyczny jest oddzielany, „sortowany” i tym samym charakteryzowany zgodnie z jego właściwościami. Tak więc określona jest dokładna struktura DNA.

Istnieje wiele możliwych zastosowań: lekarze stosują test PCR do badania, na przykład, rozmazów na koronawirusy, oddawania krwi na HIV lub badania noworodków pod kątem możliwych chorób dziedzicznych. Infekcje bakteryjne - na przykład patogenem gruźlicy - lub infekcje pasożytnicze (malaria) mogą być również wyjaśnione za pomocą PCR.

Pomagają również w medycynie sądowej w skazaniu przestępców na podstawie ich genetycznego odcisku palca lub są wykorzystywane jako testy na ojcostwo.

Wszystkie te zastosowania są podsumowane terminem diagnostyka molekularna. PCR znajduje zatem praktyczne zastosowanie w badaniach, diagnostyce i kryminalistyce daleko poza wykrywaniem patogenu Sars-CoV-2.

(Corona) Test PCR kontra szybki test PCR

Zwykle ocena testu PCR odbywa się w specjalistycznym laboratorium. Oznacza to, że materiał próbki jest tam przesyłany i badany. Wynik zwykle otrzymuje się kilka dni później.

Różne startupy (GNA Biosolutions, Spindiag) zaprezentowały ostatnio nowe typy mobilnych urządzeń testowych. W tym celu otrzymali również specjalne zezwolenia Federalnego Instytutu ds. Leków i Wyrobów Medycznych (BfArM). Z pomocą tych mobilnych urządzeń testowych PCR, test PCR byłby również możliwy bez specjalistycznego laboratorium.

Takie podejście ma ogromny potencjał, ponieważ wiarygodny wynik testu może być dostępny w ciągu kilku godzin bezpośrednio w miejscu pobrania próbki (centrum testowym).

Nie można jeszcze ocenić, w jakim stopniu takie systemy szybkich testów PCR zwyciężą w praktyce. Nie wiadomo też jeszcze, jak szybko centra testowe będą zaopatrywane w te urządzenia na całym świecie.

W dającej się przewidzieć przyszłości „zwykłe” laboratoryjne testy PCR będą zatem nadal przeprowadzane, co powoduje pewne opóźnienie między pobraniem próbki a wynikiem testu.

Jak wiarygodny jest test PCR?

PCR to sprawdzona metoda wykrywania w diagnostyce molekularnej i medycynie. Jest uważany za tzw. złoty standard o bardzo niskim poziomie błędu. Testy charakteryzują się szczególnie bardzo wysoką czułością i swoistością.

Czułość oznacza wiarygodność, z jaką test znajduje materiał genetyczny do wykrycia.

Specyficzność oznacza pewność, z jaką test stwierdza, że ​​dany materiał genetyczny nie występuje w próbce.

Kiedy testy PCR działają w przypadku infekcji Sars CoV-2?

Z reguły test PCR wykrywa infekcję koronową na dwa do trzech dni przed i do 20 dni po wystąpieniu objawów. Nawet w przypadku osób zakażonych, które pozostają całkowicie wolne od objawów, test działa w krytycznym oknie czasowym, w którym mogą zarazić innych.

W pojedynczych przypadkach dowód na to jest możliwy nawet po 60 dniach od pojawienia się objawów choroby.

Pierwszego dnia po infekcji koronowej test PCR może również być negatywny, nawet jeśli infekcja jest obecna. W takim przypadku w czasie badania cytologicznego w gardle było za mało wirusów. Jeśli jednak istnieje uzasadnione podejrzenie infekcji, lekarze zwykle przeprowadzają kolejny test PCR w kolejnych dniach.

możliwe źródła błędów

Poziom błędów w procesie kopiowania DNA jest w praktyce znikomy. Chociaż polimerazy DNA nigdy nie działają prawidłowo, prawie nie odgrywają roli w procesie testu PCR.

W praktyce możliwe źródła błędów leżą w procesie pobierania próbek: dlatego ważne jest, aby wymazy wykonywał przeszkolony personel medyczny. Próbki śliny i płukania gardła mogą prawdopodobnie zmniejszyć dokładność, ponieważ występują tutaj efekty rozcieńczenia.

Jak działa test PCR?

Test PCR jest przeprowadzany na przykład przez lekarza rodzinnego lub w specjalnych ośrodkach testowych. Najpierw próbkę pobierają lekarze lub przeszkoleni pracownicy służby zdrowia. Zazwyczaj do badania pobierany jest wymaz z górnych dróg oddechowych. Zwykle przybiera to formę wymazu z ust lub nosa i gardła.

Możliwe jest również płukanie gardła roztworem do płukania. Próbka krwi jest nietypowa do wykrywania korony – ale szeroko rozpowszechniona, na przykład w badaniach przesiewowych noworodków.

Niezależnie od rodzaju pobranej próbki materiał genetyczny znajduje się na waciku, w roztworze do płukania lub w kropli krwi. Ten materiał próbki jest wysyłany do laboratorium, gdzie jest izolowany i oczyszczany.

Test PCR dzieli się następnie na dwa etapy:

• PCR: Na tym etapie ilość oryginalnego materiału genetycznego jest mnożona.
• Elektroforeza: W drugim etapie segmenty genomu są „sortowane” według wielkości. W ten sposób można scharakteryzować próbkę – określić drobną strukturę materiału genetycznego.

Krok 1: PCR - „Reakcja łańcuchowa polimerazy”

„PCR” jest pierwszym z dwóch etapów roboczych: Tutaj mnoży się ilość istniejącego wyjściowego DNA. Ponieważ tylko wtedy, gdy materiał genetyczny jest dostępny w wystarczającej ilości, można go zbadać. W większości jest to ludzkie DNA, a testy na koronawirusa to odpowiednio wirusowe RNA.

Skrót PCR oznacza angielski termin „Polymerase Chain Reaction”.

Co jest potrzebne do PCR?

Wyjściowe DNA znajduje się w naczyniu reakcyjnym ze specjalnymi substancjami. Istniejący materiał genetyczny służy jako matryca, która jest kopiowana w obecności określonych enzymów (polimerazy Taq) i pewnych podstawowych elementów budulcowych DNA.

Proces kopiowania odbywa się w kilku - powtarzalnych - cyklach (cyklach).

W szczególności łączy się następujące substancje:

• Początkowe DNA: materiał próbki do replikacji.
• Podstawowe elementy budulcowe DNA: Są to nukleozasady adenina, tymina, cytozyna i guanina.
• Polimeraza DNA: Enzym, który łączy poszczególne bloki budulcowe DNA, tworząc dobrze zdefiniowaną nić DNA. Nowo uzyskana nić jest lustrzanym (komplementarnym) obrazem oryginalnego materiału wyjściowego.
• Roztwór buforowy: Reakcja łańcuchowa polimerazy zachodzi w fizjologicznym roztworze buforowym. Zapewnia to warunki zbliżone do tych występujących w ludzkich komórkach. Ten roztwór utrzymuje stabilne pH, a także zawiera jony magnezu. Te kontrolowane warunki są niezbędne do zapewnienia funkcjonalności polimerazy DNA.
• Startery: składają się z 16 do 24 par zasad i służą jako pozycja startowa i sygnał startowy. Startery pokazują polimerazę DNA, w którym punkcie (początkowego DNA) rozpoczyna się proces kopiowania.

Jak wykonuje się test PCR?

Ponieważ wszystkie substancje wymagane do PCR znajdują się teraz w naczyniu reakcyjnym, można rozpocząć właściwy proces kopiowania materiału genetycznego. Jest to tylko uruchamiane, kontrolowane i ponownie zatrzymywane przez temperaturę.

Naczynie reakcyjne jest w konsekwencji ogrzewane lub chłodzone w ukierunkowany sposób do różnych temperatur. Odbywa się to za pomocą specjalnego urządzenia - tak zwanego termocyklera. Cała reakcja trwa około jednej do dwóch godzin.

Poszczególne etapy cyklu PCR to:

• Denaturacja podwójnych nici DNA: Próbka jest podgrzewana do około 90 stopni Celsjusza. W rezultacie oryginalna podwójna nić DNA rozpada się na dwie oddzielne (komplementarne) pojedyncze nici.
• Mocowanie podkładu: Temperatura jest obniżona do nieco poniżej 60 stopni Celsjusza. W rezultacie startery (startery lewe i lewe) przyłączają się do określonych pozycji na odpowiednich pojedynczych niciach DNA.
• Rozszerzenie: Temperatura wzrasta do nieco powyżej 70 stopni Celsjusza. Polimeraza DNA rozpoczyna teraz swoją pracę w tej optymalnej temperaturze. Przyłącza się do pozycji starterów i krok po kroku wydłuża oryginalną pojedynczą nić DNA, aż do uzyskania dokładnej (komplementarnej) kopii (synteza DNA).

Po zakończonym cyklu temperatura zostaje ponownie podniesiona do około 90 stopni Celsjusza – cykl zaczyna się od nowa.

Stosując metodę PCR, sekwencje DNA mogą być replikowane do około trzech kilopar zasad (kbp). Odpowiada to około 3000 podstawowych cegiełek DNA połączonych w „łańcuch”. Dla porównania: ludzki genom przechowuje plany i informacje dotyczące działania komórki w około trzech miliardach par zasad – z kolei genom koronawirusa składa się z 30 000 par zasad. Test PCR może być użyty tylko do odtworzenia i zbadania krótkich odcinków całego DNA.

Podkłady są kluczowe

Wybór starterów ma kluczowe znaczenie dla procesu PCR. Na przykład w diagnostyce Sars-CoV-2 stosuje się kilka starterów (multipleks PCR).

Testy Corona PCR szukają trzech różnych genów wirusa: Ogólna specyficzność wzrasta do prawie 99,99%. Oznacza to, że przy tak wysokim wskaźniku trafień jest tylko jeden test fałszywie dodatni na 10 000 badań (jeśli próbka została pobrana prawidłowo).

Ile jest teraz skopiowanego materiału genetycznego?

Załóżmy, że po pierwszym cyklu są dwie identyczne podwójne nici DNA.

Po każdym cyklu ilość (kopiowanego) materiału genetycznego podwaja się. Więc ilość DNA rośnie wykładniczo.

Innymi słowy: po drugim cyklu są cztery identyczne podwójne nici - po trzecim cyklu osiem podwójnych nici - po czwartym cyklu 16 podwójnych nici, a po piątym cyklu już 32 podwójne nici.

Specjaliści medyczni zwykle powtarzają ten proces około dwudziestu do trzydziestu razy.

Mówiąc metaforycznie, oznacza to: nawet jeśli na początku w próbce znaleziono tylko jedną podwójną nić DNA, po dwudziestu cyklach w naczyniu reakcyjnym będzie już milion identycznych kopii.

Co oznacza wartość Ct?

Liczba zakończonych cykli PCR podana jest w postaci tzw. wartości Ct. „Ct” pochodzi od angielskiego terminu „cycle threshold”. Ta wartość Ct umożliwia stwierdzenie o ilości poszukiwanego materiału genetycznego.

Przy niskiej wartości Ct wynoszącej 20, wyjściowego materiału genetycznego jest dużo. Jeśli jednak wartość Ct jest wysoka – około 30 cykli – jest odpowiednio mało DNA. Dlatego cykl PCR musi być przeprowadzany częściej.

Krok 2: Elektroforeza „Sortowanie według rozmiaru”

Wreszcie, jeśli istnieje wystarczająca ilość „wzbogaconego” materiału genetycznego, może nastąpić tak zwana elektroforeza. Naukowcy wykorzystują pewną właściwość DNA: jego ładunek elektryczny.

Poszczególne bloki budulcowe DNA są połączone ze sobą za pomocą (ujemnie) naładowanego szkieletu cukrowo-fosforanowego. Im dłuższa jest dana sekwencja DNA, tym wyższy jest jej ładunek elektryczny.

Jeśli materiał genetyczny zostanie umieszczony w określonym nośniku (agaroza) i zostanie przyłożone napięcie elektryczne, segmenty DNA zaczynają się poruszać ze względu na swój ładunek. Ponieważ dłuższy odcinek DNA przemieszcza się szybciej niż krótszy fragment, rozdzielają się one według rozmiaru.

W ten sposób można zbadać i scharakteryzować materiał genetyczny. W praktyce nieznana próbka ze znanym odniesieniem jest zwykle umieszczana na „linii początkowej” i porównywana ze sobą po pewnym czasie.

Jeśli „prędkość migracji” jest taka sama dla obu sekwencji, oznacza to, że: Wykrycie jest bardzo prawdopodobne – gen, którego szukasz, jest zawarty w próbce.

Specjalny przypadek koronawirusa: przygotowanie próbki i RT-PCR

Szczególnym przypadkiem jest wykrycie patogenu dla koronawirusa Sars-CoV-2 jest jednym z tak zwanych wirusów RNA. Oznacza to, że genom Sars-CoV-2 ma postać RNA (kwasu rybonukleinowego).

RNA różni się od DNA tylko na kilka sposobów. Między innymi jest dostępna jako pojedyncza nić i jest oparta na cukrowej rybozie zamiast 2” dezoksyrybozie. Nukleozasadową tyminę również zastąpiono uracylem jako czwartą zasadą.

Ten wirusowy RNA musi zostać „transkrybowany” do DNA przed regularnym testem PCR. Proces ten nazywa się odwrotną transkrypcją (RT) - stąd określenie RT-PCR. W trakcie tego procesu uzyskuje się pojedynczą nić cDNA („komplementarne DNA”). W kolejnym etapie pojedyncza nić cDNA jest uzupełniana przez drugą, lustrzanie odwróconą nić DNA.

Pod koniec przygotowania próbki znajduje się podwójna nić DNA, która odpowiada oryginalnemu projektowi RNA wirusa: tylko ta podwójna nić może być teraz użyta jako matryca w teście PCR.

Ile czasu zajmuje uzyskanie wyniku?

Po wysłaniu próbki do laboratorium wynik otrzymasz zwykle po jednym lub dwóch dniach roboczych.W centrach testowych, które często badają próbki na miejscu, może to zająć tylko kilka godzin. Okres czasu zależy w dużej mierze od danego centrum testowego i jego logistyki.

Mimo skomplikowanych procesów pracy nowoczesne laboratoria są w stanie przeprowadzić testy PCR z dużą wydajnością. W realizacji pomagają specjalne zautomatyzowane urządzenia.

Test PCR jest nadal uważany za stosunkowo „wolną”, ale bardziej niezawodną metodę wykrywania.

Co się stanie, jeśli wynik będzie pozytywny?

Jeśli próbka została pobrana prawidłowo, pozytywny wynik testu PCR oznacza, że ​​badana osoba z dużym prawdopodobieństwem zostanie zarażona Sars-CoV-2.

Jeśli za pomocą testu PCR potwierdzono zakażenie koronawirusem, wydział zdrowia otrzyma wiadomość z odpowiedniego laboratorium o pozytywnym wyniku testu. W takim przypadku wydział zdrowia zarządzi izolację lub kwarantannę.

Czy jestem automatycznie zaraźliwy, jeśli otrzymam pozytywny wynik testu PCR?

W większości przypadków tak. Ale nie zawsze. Wynik testu PCR należy zawsze interpretować w kontekście. Pozytywny wynik testu oznacza przede wszystkim, że masz w sobie materiał wirusowy.

Jeśli niedawno cierpiałeś na Covid 19 (kilka dni), test PCR może nadal być pozytywny – nawet jeśli jesteś już zdrowy. Jest to szczególny przypadek i wada bardzo czułego testu, ponieważ może on również wykryć fragmenty wirusa, które nie mogą się rozmnażać.

Czasami przydatny jest dodatkowy test na przeciwciała

W takich przypadkach test na przeciwciała daje pewność, która zapewnia ważność testu PCR. Najlepiej omówić to z lekarzem. Mogą pomóc w prawidłowej interpretacji wyniku testu PCR.

Co zrobić, jeśli wynik jest ujemny

Negatywny wynik testu PCR oznacza z dużym prawdopodobieństwem, że nie zaraziłeś się Covid-19 podczas pobierania próbki i dlatego nie jesteś obecnie zakaźny. Jednak możesz być we wczesnych stadiach infekcji.

Zazwyczaj infekcje koronowe można wykryć dopiero od drugiego lub trzeciego dnia po zakażeniu. Rezultatem nie jest więc darmowy bilet. Dlatego należy nadal przestrzegać zasad zachowania odległości i higieny oraz nadal nosić maskę FFP2 – dla siebie i dla ochrony innych.

Test PCR u dzieci

Test pediatryczny PCR nie różni się od testu PCR dla dorosłych. Zarówno pobieranie próbek, jak i interpretacja wyników dotyczą zarówno dzieci, jak i dorosłych.

Jakie są zagrożenia związane z testem PCR?

Test PCR nie stwarza ryzyka fizycznego. Tylko pobranie próbki wymazem z nosogardzieli jest przez niektórych odbierane jako irytujące lub nieprzyjemne.

Ile kosztuje test PCR?

Wszelkie koszty poniesione na test PCR zostaną pokryte, jeśli lekarze prowadzący leczenie lub wydział zdrowia zatwierdzą taki test. Zwrot kosztów jest zwykle rozważany, jeśli masz już własne objawy lub miałeś bezpośredni kontakt z osobami zarażonymi.

Nawet w przypadku pozytywnego wyniku szybkiego lub samokontroli masz prawo do bezpłatnego testu PCR.

Uwaga: Jeśli wykonałeś badanie w domu i uzyskałeś pozytywny wynik, powinieneś niezwłocznie umówić się telefonicznie na wizytę u lekarza rodzinnego. Twój lekarz prowadzący omówi z Tobą dalszą procedurę telefonicznie.

Alternatywnie najlepiej zadzwonić pod numer 116 117, aby zarejestrować się na test PCR. Do czasu testu potwierdzającego najlepiej jest zostać w domu, aby chronić siebie i innych.

Tagi.:  zdrowe stopy palenie niespełnione pragnienie posiadania dzieci